Edycja DNA w ludzkich zarodkach: badacze porównali CRISPR-Cas9 z edycją zasad

Badanie opublikowane w „Nature” dostarcza nowych danych na temat sposobu, w jaki wczesne ludzkie zarodki reagują na uszkodzenia DNA powstające podczas edycji genomu. Naukowcy porównali następstwa klasycznej edycji z wykorzystaniem CRISPR-Cas9, prowadzącej do powstawania dwuniciowych pęknięć DNA, z edycją zasad, która może wprowadzać zmiany bez przecinania obu nici DNA. Wyniki wskazują, że uszkodzenia generowane przez edytory zasad są naprawiane znacznie sprawniej, jednak nawet ta bardziej precyzyjna strategia może prowadzić do niepożądanych zmian chromosomalnych, mozaikowości oraz zaburzeń rozwoju zarodka. Autorzy podkreślają, że obecne wyniki nie uzasadniają zastosowania takich metod w medycynie reprodukcyjnej.

W artykule:

• Dlaczego naprawa DNA jest szczególnie istotna we wczesnym rozwoju zarodkowym
• Jak porównano CRISPR-Cas9 z edycją zasad
• Jakie wyniki uzyskano podczas edycji genów PCSK9 i HBG
• Jak edycja wpływała na rozwój zarodków i możliwość uzyskania komórek macierzystych
• Jakie problemy bezpieczeństwa pozostają nierozwiązane
• Co wyniki oznaczają dla przyszłości korekcji chorób dziedzicznych

Naprawa DNA we wczesnym zarodku pozostaje kluczowym problemem edycji genomu

Mechanizmy naprawy DNA są niezbędne do zachowania integralności materiału genetycznego komórek. W okresie bardzo wczesnego rozwoju zarodkowego mają one szczególne znaczenie, ponieważ komórki intensywnie się dzielą, a zmiana powstała na tym etapie może zostać przekazana dużej liczbie komórek rozwijającego się organizmu.

Z punktu widzenia potencjalnej korekcji wariantów genetycznych odpowiedzialnych za choroby dziedziczne znaczenie ma więc nie tylko to, czy narzędzie edycji genomu potrafi zmienić pożądaną sekwencję DNA. Równie ważne jest to, w jaki sposób komórka reaguje na uszkodzenie DNA powstające podczas samej procedury oraz czy naprawa przebiega bez powstawania dodatkowych zmian w genomie.

Badanie opublikowane w czasopiśmie Nature przez zespół kierowany przez Dietera Egliego, z pierwszym autorem Štěpánem Jeřábkiem, miało właśnie taki charakter. Autorzy nie próbowali opracować gotowej procedury klinicznej przeznaczonej do genetycznego modyfikowania zarodków. Celem było porównanie odpowiedzi wczesnych ludzkich zarodków na odmienne rodzaje zmian DNA wywoływanych przez różne systemy edycji genomu.

Štěpán Jeřábek jest związany z Columbia University oraz Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences (IOCB Prague). W badaniu uczestniczyli również m.in. Chanju Jung, Michelle Kappy, Michal Doležal, Iva Pichová i Dieter Egli, a prace obejmowały współpracę kilku ośrodków badawczych.

CRISPR-Cas9 i edycja zasad powodują odmienne rodzaje uszkodzeń DNA

Jednym z najważniejszych elementów badania było bezpośrednie porównanie dwóch zasadniczo różnych sposobów ingerowania w genom.

Dwuniciowe pęknięcie DNA po zastosowaniu CRISPR-Cas9

Klasyczne zastosowanie CRISPR-Cas9 polega na przecięciu obu nici DNA w określonym miejscu genomu. Powstałe dwuniciowe pęknięcie DNA musi następnie zostać naprawione przez mechanizmy komórkowe. To właśnie etap naprawy może prowadzić do niepożądanych konsekwencji, w tym delecji większych fragmentów DNA oraz nieprawidłowości chromosomalnych.

W abstrakcie publikacji autorzy zwracają uwagę, że wcześniejsze badania nad ludzkimi zarodkami wskazywały na genotoksyczność dwuniciowych pęknięć indukowanych przez Cas9, w tym na możliwość powstawania aneuploidii oraz dużych delecji.

Edycja zasad bez pełnego przecięcia obu nici DNA

Drugim podejściem była edycja zasad, czyli technologia umożliwiająca zmianę pojedynczych nukleotydów bez konieczności tworzenia klasycznego dwuniciowego pęknięcia DNA. W analizowanym eksperymencie wykorzystano edytory zasad generujące m.in. nacięcie jednej nici DNA oraz niedopasowanie zasad, które następnie jest przetwarzane przez mechanizmy naprawcze komórki.

Badacze oceniali reakcję ludzkich zarodków na edycję dwóch loci: PCSK9 oraz HBG. Szczegółowa analiza obejmowała zarówno skuteczność wprowadzenia zmian, jak i następstwa dla genomu oraz dalszego rozwoju zarodków.

Bardzo wysoka skuteczność edycji PCSK9, ale nie całkowity brak niepożądanych zmian

Jednym z najważniejszych wyników było zastosowanie adenozynowego edytora zasad ABE8e-V106W w postaci białka. Edytor podawano w czasie zapłodnienia. Według publikacji umożliwiło to uzyskanie edycji we wszystkich analizowanych allelach PCSK9.

Co istotne, zarodki poddane takiej procedurze mogły rozwijać się do stadium blastocysty. Badaczom udało się także wyprowadzić linie komórek macierzystych homozygotycznych pod względem wprowadzonej zmiany.

Autorzy nie stwierdzili insercji ani delecji w miejscu edycji w analizowanym układzie. Jest to istotna różnica w porównaniu z klasycznym wykorzystaniem Cas9 powodującym dwuniciowe pęknięcie DNA. Nie oznacza to jednak, że edycja zasad była pozbawiona skutków ubocznych.

W pojedynczych przypadkach obserwowano pęknięcia chromosomowe w miejscu docelowym oraz nieprawidłowości chromosomalne. Stwierdzano także mozaikowość zmian występujących zarówno w dodatkowych pozycjach znajdujących się w obrębie obszaru działania edytora, jak i poza właściwym miejscem docelowym.

Mozaikowość oznacza w tym przypadku, że nie wszystkie komórki rozwijającego się zarodka muszą mieć identyczny profil zmian genetycznych. Z perspektywy ewentualnych przyszłych zastosowań reprodukcyjnych jest to problem szczególnie istotny, ponieważ analiza niewielkiej liczby komórek nie musi w pełni odzwierciedlać struktury genetycznej całego zarodka.

Sposób dostarczenia edytora wpływał na dalszy rozwój zarodków

Badanie zwraca również uwagę na znaczenie formy, w jakiej narzędzie edycji genomu jest dostarczane do komórki.

Michal Doležal i Iva Pichová z IOCB Prague uczestniczyli w przygotowaniu i oczyszczaniu edytorów białkowych wykorzystywanych w doświadczeniach prowadzonych przez współpracowników z Columbia University. Według informacji przedstawionych przez zespół podawanie edytorów bezpośrednio w postaci białka było zgodne z dalszym rozwojem zarodków w zastosowanym modelu eksperymentalnym.

Odmienne wyniki uzyskano, gdy edytor wprowadzano jako mRNA. W publikacji w „Nature” autorzy podają, że takie podejście prowadziło do częstego zatrzymania rozwoju zarodków. Zjawisko wiązano z aktywnością deaminazy niezależną od RNA przewodnikowego.

Różnica pomiędzy podaniem gotowego białka a mRNA może wynikać m.in. z czasu utrzymywania się aktywności układu edycyjnego w komórce. W przypadku mRNA komórka musi najpierw wytworzyć białko edytora, a jego aktywność może utrzymywać się przez inny okres niż po bezpośrednim dostarczeniu przygotowanego białka. W kontekście bezpieczeństwa edycji genomu czas i intensywność ekspozycji na aktywny enzym mają zasadnicze znaczenie.

Komórki macierzyste z sześciodniowych edytowanych zarodków

Ważnym elementem pracy było również skuteczne wyprowadzenie komórek macierzystych z edytowanych, sześciodniowych zarodków.

Ma to znaczenie metodologiczne, ponieważ materiał uzyskany bezpośrednio z bardzo wczesnego zarodka jest ograniczony. Linie komórek macierzystych zapewniają natomiast większą ilość materiału genetycznego do szczegółowych analiz i umożliwiają ocenę, w jaki sposób wprowadzone zmiany utrzymują się w kolejnych pokoleniach komórek.

Takie podejście może ułatwić wykrywanie zmian, które byłyby trudne do zidentyfikowania podczas analizy jedynie niewielkiej liczby komórek zarodka.

Edycja zasad jest precyzyjniejsza, ale nadal nie spełnia wymagań dla zastosowań reprodukcyjnych

Wyniki pracy pokazują istotną różnicę biologiczną między uszkodzeniami powstającymi podczas edycji zasad a dwuniciowymi pęknięciami DNA wywoływanymi przez Cas9. Zmiany generowane przez edytor zasad były przez wczesne ludzkie zarodki naprawiane znacznie skuteczniej.

Nie oznacza to jednak, że technologia może obecnie zostać uznana za bezpieczną do korekcji wariantów genetycznych w medycynie reprodukcyjnej.

W badaniu zidentyfikowano kilka kategorii problemów wymagających dalszych analiz:

• rzadkie pęknięcia chromosomowe występujące w miejscu docelowym,
• nieprawidłowości chromosomalne,
• mozaikowość zmian w dodatkowych pozycjach objętych działaniem edytora,
• mozaikowość zmian poza właściwym miejscem docelowym,
• zależność profilu bezpieczeństwa od sposobu dostarczenia systemu edycyjnego,
• zatrzymywanie rozwoju części zarodków po zastosowaniu edytora w postaci mRNA.

Z tego względu brak insercji i delecji w jednym analizowanym układzie nie powinien być utożsamiany z pełnym bezpieczeństwem edycji genomu. Ocena bezpieczeństwa musi obejmować nie tylko krótkie sekwencje DNA otaczające miejsce edycji, ale również strukturę chromosomów, zmiany poza miejscem docelowym, mozaikowość oraz wpływ procedury na rozwój zarodka.

Autorzy publikacji stwierdzają wprost, że obserwowane niepożądane konsekwencje dla genomu i rozwoju obecnie wykluczają kliniczne zastosowanie tej strategii w reprodukcji.

Potencjalna korekcja chorób dziedzicznych pozostaje perspektywą badawczą

Możliwość skorygowania patogennego wariantu genetycznego jeszcze na etapie zarodkowym jest jednym z najbardziej dyskutowanych potencjalnych zastosowań edycji genomu. Teoretycznie taka zmiana mogłaby znaleźć się w wielu lub wszystkich komórkach powstającego organizmu, a w przypadku ingerencji w linię zarodkową mogłaby być także przekazywana kolejnym pokoleniom.

Właśnie z tego powodu próg bezpieczeństwa dla takiej procedury musiałby być wyjątkowo wysoki. Niepożądana zmiana genomowa powstała podczas edycji zarodka mogłaby mieć konsekwencje znacznie szersze niż analogiczna zmiana występująca podczas terapii somatycznej ograniczonej do wybranej populacji komórek pacjenta.

Nowa praca nie jest więc demonstracją gotowej terapii chorób dziedzicznych. Dostarcza natomiast danych mechanistycznych, które pomagają zrozumieć, jakie rodzaje uszkodzeń DNA są lepiej tolerowane i naprawiane przez komórki bardzo wczesnego ludzkiego zarodka.

Może to mieć znaczenie dla dalszego rozwoju technologii edycji genomu, także poza obszarem medycyny reprodukcyjnej. Im dokładniej poznane zostaną mechanizmy odpowiedzi komórki na określone typy zmian DNA, tym większa będzie możliwość projektowania narzędzi ograniczających powstawanie niepożądanych następstw edycji.

Badanie podstawowe, a nie próba kliniczna

Przy interpretacji wyników istotne jest właściwe określenie charakteru pracy. Było to badanie eksperymentalne, a nie badanie kliniczne dotyczące leczenia pacjentów lub zastosowania zmodyfikowanych zarodków w procedurach rozrodu wspomaganego.

Eksperymenty prowadzono w laboratorium Dietera Egliego pod nadzorem komisji etycznej Columbia University. Autorzy podkreślają, że celem pracy było poznanie biologii naprawy DNA podczas najwcześniejszych etapów rozwoju człowieka, a nie opracowanie procedury genetycznej modyfikacji zarodków przeznaczonej do zastosowania klinicznego.

Rozróżnienie to jest szczególnie ważne w przypadku badań nad edycją genomu człowieka. Techniczna możliwość wprowadzenia określonej zmiany nie jest równoznaczna z wykazaniem bezpieczeństwa procedury ani z uzasadnieniem jej zastosowania medycznego.

Wymiar etyczny badań nad edycją genomu zarodków

Badania nad modyfikacją genomu ludzkich zarodków mają również szczególny wymiar etyczny. Dotyczą bowiem zmian, które potencjalnie mogłyby oddziaływać nie tylko na przyszłą osobę powstałą z danego zarodka, ale – w przypadku zmian obecnych w komórkach rozrodczych – również na kolejne pokolenia.

Jan Konvalinka, dyrektor IOCB Prague, zwrócił uwagę, że debata etyczna dotycząca tego rodzaju badań jest zarówno uzasadniona, jak i potrzebna. W jego ocenie rolą badań podstawowych jest nie tylko przesuwanie granic wiedzy, ale również dokładniejsze określanie możliwości i ograniczeń nowych technologii.

Wyniki opublikowane w „Nature” dobrze ilustrują tę kwestię. Edycja zasad pozwoliła ograniczyć część problemów charakterystycznych dla dwuniciowych pęknięć DNA, ale jednocześnie ujawniła kolejne potencjalne źródła ryzyka. Z punktu widzenia dalszych badań nie wystarcza więc odpowiedź na pytanie, czy możliwe jest skuteczne zmodyfikowanie wybranego genu. Konieczne jest również wykazanie, że procedura nie prowadzi do zmian w innych miejscach genomu, zaburzeń chromosomalnych, mozaikowości ani nieprawidłowości rozwojowych.

Źródło: Nature, Highly efficient base editing at PCSK9 and normal human embryo development
DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-026-11118-x