Nowa metoda przesiewowa wykrywa neurotoksyczne substancje bez użycia tradycyjnych testów na zwierzętach

„Do tej pory na całym świecie w ramach oficjalnych badań regulacyjnych przebadano pod kątem działania neurotoksycznego jedynie około 200 substancji” – mówi dr David Leuthold, ekotoksykolog z UFZ i główny autor badania. „Powodem jest to, że procedury te są złożone, czasochłonne i kosztowne. Dochodzi również aspekt etyczny, ponieważ badania te są w większości prowadzone na szczurach i myszach”. Brakuje więc szybkiej i niedrogiej metody przesiewowej, która mogłaby szybko i wiarygodnie wykrywać neurotoksyczne działanie substancji chemicznych i złożonych mieszanin chemicznych bez konieczności stosowania tradycyjnych testów na zwierzętach. I właśnie w tę lukę wpisuje się badanie UFZ.

Zespół UFZ zastosował model zarodka danio pręgowanego, powszechnie używany w badaniach toksykologicznych. Jedną z jego zalet jest to, że około 70% genów danio pręgowanego (Danio rerio) występuje również u człowieka, dzięki czemu uzyskane wyniki można prawdopodobnie przenieść na ludzi. Ponadto zarodki danio, ze względu na niewielki rozmiar i szybki rozwój, świetnie nadają się do badań wysokoprzepustowych, dostarczając cennych informacji na temat funkcjonowania układu nerwowego.

Wykorzystując ten model, badacze opracowali procedurę przesiewową umożliwiającą szybkie testowanie substancji chemicznych pod kątem działania neurotoksycznego – w tym identyfikację związków zaburzających procesy uczenia się i pamięci. Jak jednak badać te procesy u zarodka ryby? „Wykorzystujemy jedną z najprostszych form uczenia się: habituację na powtarzający się bodziec” – wyjaśnia Leuthold. „Sygnał akustyczny wywołuje odruch ucieczki. Jeśli jednak jest powtarzany, ryba przyzwyczaja się do niego i przestaje reagować na bodziec, który nie stanowi zagrożenia”. Zmiana bodźców świetlnych (jasność–ciemność) także wpływa na zachowanie pływackie zarodków. Naukowcy połączyli bodźce akustyczne i wzrokowe, modyfikując ich częstotliwość, kolejność, sekwencję czasową, czas trwania i intensywność, tworząc zdefiniowaną procedurę testową.

Na początku metodę przetestowano na substancjach, których wpływ na zachowanie danio wobec bodźców wizualnych i akustycznych był znany. „Substancje neurotoksyczne mogą działać bardzo różnie. Niektóre uniemożliwiają habituację do bodźca akustycznego, przez co odruch ucieczki jest stale wyzwalany. Inne powodują znacznie szybszą habituację. Mogą też zmieniać inne aspekty zachowania” – mówi Leuthold. „Na podstawie tych znanych substancji opracowaliśmy swoisty odcisk palca zachowania, co pozwala wnioskować o tym, jak ekspozycja na dany związek zakłóca funkcjonowanie układu nerwowego”.

Korzystając z tej platformy, badacze przetestowali dziesięć substancji oddziałujących na układ receptorów NMDAR, istotny dla procesów uczenia i pamięci. Nie było wiadomo, czy wykazują one działanie neurotoksyczne u danio. „Nasze badanie przesiewowe wykazało istotne zaburzenia zachowania uczeniowego dla sześciu substancji, co jednoznacznie potwierdzało ich działanie neuroaktywne” – mówi Leuthold. Szczególną uwagę zwrócił chlorofen, biocyd, który nie przyspieszał habituacji do bodźców akustycznych, lecz całkowicie blokował proces uczenia. Co więcej, pod jego wpływem zarodki nadal reagowały na bodźce akustyczne, ale już nie na wizualne. „To zjawisko określamy mianem paradoksalnej ekscytacji i występuje ono w przypadku niektórych środków znieczulających” – wyjaśnia badacz. Nie było dotąd wiadomo, że chlorofen może działać w taki sposób, dlatego zespół postanowił zbadać mechanizm jego działania.

Analiza literatury wykazała, że paradoksalna ekscytacja może być wywoływana przez określone receptory GABAA, istotne dla ośrodkowego układu nerwowego. Po ich zablokowaniu u zarodków danio eksponowanych na chlorofen powracała reakcja na bodźce wzrokowe, lecz nie przywracało to prawidłowego uczenia. Oznacza to, że chlorofen działa wielotorowo.

Dalsze testy z wykorzystaniem neuronów mysich i ludzkich modeli komórkowych, prowadzone we współpracy z Uniwersytetem w Lipsku i Leibniz-Institut für Umweltmedizin w Düsseldorfie, potwierdziły mechanizm działania chlorofenu przez receptory GABAA. Modele komputerowe przewidywały także możliwość wiązania się tego związku z tymi receptorami.

Badacze podejrzewają, że drugi mechanizm działania chlorofenu może być związany z określonymi kanałami potasowymi. Weryfikując tę hipotezę, przetestowano lek przeciwbólowy flupirtynę, działającą poprzez te kanały, i uzyskano niemal identyczny wzorzec zaburzeń zachowania jak w przypadku chlorofenu.

Zespół UFZ ma nadzieję, że ta metoda przesiewowa pozwoli na szeroką, szybką i tanią ocenę neurotoksyczności substancji chemicznych i ich mieszanin, zgodną z Europejskim Zielonym Ładem i strategią chemiczną UE, umożliwiając identyfikację zagrożeń zanim zaszkodzą ludziom i środowisku.

Prof. dr Tamara Tal, kierująca zespołem, podkreśla: „Organy regulacyjne są często sceptyczne wobec stosowania danych toksykologicznych z badań na danio do regulacji dotyczących ludzi. Gdy jednak udowodnimy, że mechanizmy zaburzeń rozwoju i funkcji mózgu są zachowane u danio, myszy i ludzi, wzmacniamy wiarygodność takich danych w wypełnianiu ogromnej luki w testach neurotoksyczności, co może przełożyć się na poprawę zdrowia publicznego”.

Źródło: Environmental Health Perspectives
DOI: http://dx.doi.org/10.1289/EHP16568