Neutrofile, rodzaj komórek odpornościowych, odgrywają kluczową rolę w obronie organizmu przed patogenami. Jednak ich migracja do uszkodzonych tkanek, takich jak mózg po udarze, może sprzyjać przewlekłemu stanowi zapalnemu i prowadzić do długotrwałych uszkodzeń. Aby przeanalizować białka neutrofili w ogniskach zapalnych i zrozumieć ich funkcjonalną dynamikę, naukowcy zwykle potrzebują milionów tych komórek – co stanowi wyzwanie, ponieważ w ogniskach zapalnych często występuje ich niewielka liczba.
Badacze z ISAS, Uniwersyteckiego Szpitala w Essen oraz Uniwersytetu w Münster opracowali metodę pozwalającą na analizę mas spektrometryczną z wykorzystaniem jedynie 1 000 neutrofili. Umożliwia to bardziej precyzyjną ocenę odpowiedzi immunologicznej w pojedynczych ogniskach zapalnych. Wyniki swoich badań, obejmujące otwartą bazę danych oraz internetowy serwis analizy proteomu neutrofili, naukowcy opublikowali w czasopiśmie Molecular & Cellular Proteomics.
Nowatorska metoda analizy proteomu neutrofili
Proteomika neutrofili, czyli analiza większości białek produkowanych przez te komórki, dostarcza istotnych informacji o ich funkcjonowaniu w warunkach chorobowych. Mimo że neutrofile stanowią około 60% leukocytów u zdrowych osób, w ogniskach zapalnych ich liczba często nie przekracza 1 000. Ograniczona dostępność materiału biologicznego była dotąd przeszkodą w badaniach, szczególnie w przypadku rzadkich populacji neutrofili, np. w nowotworach.
Dotychczas naukowcy musieli łączyć próbki od wielu pacjentów lub zwierząt, co mogło zaburzać wyniki. Nowe podejście pozwala na analizę proteomu neutrofili zaledwie z 1 000 komórek pobranych z pojedynczego ogniska zapalnego u jednego pacjenta lub zwierzęcia. To rozwiązanie zwiększa precyzję badań oraz ogranicza wykorzystanie zwierząt doświadczalnych.
„Nasza metoda pozwala na szczegółową analizę neutrofili przy zachowaniu minimalnych zasobów materiału badawczego, co jest szczególnie istotne dla ograniczenia liczby badań na zwierzętach” – mówi Susmita Ghosh, pierwsza autorka badania i doktorantka w ISAS.
Baza danych jako narzędzie referencyjne
Aby zredukować liczbę wymaganych komórek do analizy proteomicznej za pomocą spektrometrii masowej LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry), badacze zoptymalizowali proces trawienia białek w trakcie przygotowania próbek oraz metodologię akwizycji danych LC-MS. W ten sposób stworzyli rozbudowane biblioteki widmowe dla neutrofili pochodzących z krwi pięciu zdrowych ludzi i pięciu zdrowych myszy.
Biblioteki zawierają około 5 300 białek ludzkich oraz 6 200 białek mysich, co dostarcza cennych informacji na temat różnic proteomicznych między neutrofilami ludzkimi i murynowymi. Te zasoby są publicznie dostępne, umożliwiając naukowcom wykorzystanie ich jako referencji w przyszłych badaniach.
Ostra reakcja na Tabasco – walidacja metody
Nową metodę zweryfikowano w dwóch niezależnych modelach zapalenia. W pierwszym badaniu analizowano neutrofile w mózgach myszy po udarze. Komórki reagowały na środowisko ubogie w glukozę, zwiększając aktywność mitochondriów i produkcję reaktywnych form tlenu.
W drugim modelu sprawdzano reakcję neutrofili ludzkich. W tym celu siedmiu uczestników badania przepłukało jamę ustną roztworem zawierającym sos Tabasco, co wywołało krótkotrwały stan zapalny. Zaobserwowano, że neutrofile przemieszczające się z krwi do miejsca zapalenia ulegały istotnym zmianom funkcjonalnym, co potwierdzono również metodą cytometrii przepływowej.
Oba modele potwierdzają, że nowa metoda oraz biblioteka widmowa mogą być stosowane do różnych rodzajów stanów zapalnych.
Kolejny krok – analiza pojedynczych komórek
Naukowcy już pracują nad dalszym rozwojem metody. „Naszym długoterminowym celem jest umożliwienie analizy proteomicznej pojedynczych komórek lub bardzo małych subpopulacji neutrofili” – mówi Ghosh. „Pierwsze wyniki uzyskane na podstawie pięciu komórek wyglądają bardzo obiecująco.”
Badacze z ISAS opracowali również interaktywną wizualizację wszystkich analizowanych białek i ich kopii, którą można znaleźć pod adresem: Zenodo DOI.
Oryginalna publikacja
Pełny artykuł można znaleźć pod adresem: ScienceDirect.
Źródło: Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften – ISAS – e. V.
